一、背景

ROSETTA 2(DE3)感受态细胞是来源于Origami 2系列菌株。而Origami 2系列菌株是卡那敏感的K-12细胞菌株，携带有TrxB和Gor基因突变提高含二硫键正确折叠蛋白的高效表达。

本菌株含有pRARE2质粒，除了能够提供原Rosetta(DE3)宿主菌含有的AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,和GGA六个稀有密码子的tRNA外，还提供了第七个稀有密码子CGG的tRNA。同时，pRARE2质粒具有氯霉素抗性。通过提供原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的在大肠杆菌中的蛋白表达水平。

Rosetta-gami 2(DE3)感受态细胞中的Gor基因突变使得菌株具有四环素抗性。

DE3是溶源性的λDE3,所以带有T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pET系列载体，及其他T7启动子系列载体。

二、使用方法

1、从-20°C冰箱中取出Nano E.coli Transfection Reagent彻底融化，放置于冰上。

注意：该试剂含长链带电化合物，允许反复冻融20次，使用完毕后继续-20°C保存。

2、取50μl Nano E.coli Transfection Reagent置于0.2 ml EP管中，加入10～100 ng质粒DNA（不可使用连接产物），枪头吹打混合均匀，冰上放置2min。

注意：放置时间不要超过30min，过长时间会导致核酸聚合，从而影响转化效价。

3、将上述混合物（50μl Nano E.coli Transfection Reagent和质粒DNA）加入到一支RTS表达感受态细胞干粉中，枪头轻轻吹打，彻底溶解细胞干粉，置于冰上15min。

注意：使用RTS表达感受态细胞干粉前，轻甩干粉至管底部，如果发现干粉已经溶解则不可使用。

4、置于42°C热激1min后，迅速置于冰上急冷2min。

5、将热激完毕的感受态细胞转移到含有450μl不含抗生素的SOC（或LB）培养基，37°C振荡（225 rpm）培养60min。使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。

6、取200μl复苏菌液涂布到含相应抗生素的LB琼脂平板表面。

7、将平板置于37°C培养，12~18小时后可出现菌落。

8、获得的表达菌，可使用IPTG进行诱导表达，从而获得重组蛋白。

三、应用

用于葡萄根瘤蚜谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因的克隆、表达及功能分析研究：

以葡萄根瘤蚜为研究对象,对其谷胱甘肽S-转移酶进行基因克隆获得了7个胞质型Dvi GSTs,并在此基础上进行了原核表达、蛋白纯化、重组蛋白的酶动力学参数测定、抗氧化能力检测以及农药对重组蛋白的离体抑制测定。

结果如下：

1、基因克隆:克隆获得了7个胞质型Dvi GSTs,分别为Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTt1、Dvi GSTo1、Dvi GSTs1、Dvi GSTs2和Dvi GSTs3,分属于四个不同的家族,即Delta、Theta、Omega和Sigma,经测序验证各基因的序列与NCBI中序列一致。7个GSTs基因开放阅读框长度范围为606-717 bp,编码201-238个氨基酸,分子质量为58.73-70.22 KD,理论等电点范围为5.15-5.23。

2、原核表达及蛋白纯化:通过构建原核表达系统得到p ET28a（+）-Dvi GSTs重组表达质粒,后转入Rosetta gami 2（DE3）感受态细胞中成功构建表达菌。经IPTG诱导表达及Ni柱纯化,最终获得了7个25-40 k D大小的可溶性目的蛋白。

3、Dvi GSTs的酶学特性分析:Dvi GSTs1的米氏常数Km最小,Dvi GSTt1的米氏常数Km最大;通过不同家族之间的对比发现,Delta家族中的Dvi GSTd1和Dvi GSTd2均表现出较强的活性,Vmax值最低的为Dvi GSTo1。

4、Dvi GSTs的抗氧化性分析:检测7个Dvi GSTs的抗氧化活性仅发现Sigma家族中Dvi GSTs2和Dvi GSTs3具有抗氧化性,且Dvi GSTs3的抗氧化性高于Dvi GSTs2。

5、Dvi GSTs的离体抑制分析:测定GSTs结构专性抑制剂及杀虫剂啶虫脒和氟虫腈对重组蛋白Dvi GSTs的活性抑制率。发现7个Dvi GSTs中仅有Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1的活性表现出能被药剂抑制。且杀虫剂啶虫脒和氟虫腈虽然对Dvi GSTd1、Dvi GSTd2、Dvi GSTs1表现出一定的抑制活性,但效果远不及GSTs结构专性抑制剂。